Transfeksiyon, moleküler biyolojide, yabancı nükleik asitlerin hücrelere sokulmasına izin veren ve araştırmacıların gen fonksiyonunu, protein ekspresyonunu ve hücresel sinyal yollarını incelemelerini sağlayan önemli bir tekniktir. Bir insan nöroblastom hücre hattı olan Tet-213 hücreleri, nöronal özellikleri nedeniyle nörobilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. Bu blog yazısında, TET-213 hücrelerinin etkili bir şekilde nasıl transfekte edileceği konusunda bazı bilgiler paylaşacağım ve bir TET-213 hücre tedarikçisi olarak deneyimimi kullanarak.
TET-213 hücrelerini anlamak
Transfeksiyon işlemine girmeden önce, Tet-213 hücrelerinin özelliklerini anlamak önemlidir. Bu hücreler bir insan nöroblastomundan türetilir ve nöritleri genişletme ve nöronal belirteçleri eksprese etme yeteneği gibi nöronal özellikler sergiler. Bunlar, standart hücre kültürü koşullarında, tipik olarak fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotiklerle desteklenmiş bir ortamda iyi büyüyen yapıştırılmış hücrelerdir.
Doğru transfeksiyon yöntemini seçmek
Her biri kendi avantajları ve sınırlamaları olan hücreleri transfekte etmek için çeşitli yöntemler vardır. Transfeksiyon yönteminin seçimi, transfekte edilecek nükleik asit tipi, hücre tipi ve istenen transfeksiyon etkinliği dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Tet-213 hücreleri için uygun bazı yaygın transfeksiyon yöntemleri:
Lipit bazlı transfeksiyon
Lipid bazlı transfeksiyon, nükleik asitlerin hücrelere sokulması için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Daha sonra endositoz yoluyla hücreler tarafından alınan nükleik asit ile kompleksler oluşturan lipit bazlı reaktiflerin kullanımını içerir. Lipid bazlı transfeksiyonun gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır ve Tet-213 hücreleri de dahil olmak üzere birçok hücre tipinde yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayabilir.
Elektroporasyon
Elektroporasyon, hücre zarında geçici gözenekler oluşturmak için bir elektrik alanı kullanan ve nükleik asidin hücrelere girmesine izin veren fiziksel bir yöntemdir. Bu yöntem, özellikle birincil hücreler gibi diğer yöntemler kullanılarak transfekte edilmesi zor olan hücrelerin transfekte edilmesi için kullanışlıdır. Bununla birlikte, elektroporasyon hücrelere daha zararlı olabilir ve yüksek transfeksiyon verimliliği elde etmek için elektroporasyon parametrelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
Viral transdüksiyon
Viral transdüksiyon, nükleik asidi hücrelere vermek için viral vektörlerin kullanımını içerir. Viral vektörler, istenen nükleik asidi taşımak için tasarlanmış ve hücreleri etkili bir şekilde enfekte edebilen virüslerden türetilir. Viral transdüksiyon yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayabilir ve Tet-213 hücreleri dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tiplerini transfekte etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, viral transdüksiyon özel ekipman ve uzmanlık gerektirir ve viral vektörlerin kullanımı ile ilişkili potansiyel güvenlik endişeleri vardır.
Hücrelerin transfeksiyon için hazırlanması
Başarılı transfeksiyon için uygun hücre hazırlığı gereklidir. Transfeksiyon için TET-213 hücreleri hazırlarken izlenecek bazı adımlar:
Hücre kültürü
FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş uygun bir hücre kültürü ortamında TET-213 hücrelerini koruyun. Üstel büyüme aşamalarını korumak için hücreleri düzenli olarak geçin. Zayıf fizyolojik durumdaki hücrelerin daha düşük transfeksiyon verimliliğine sahip olabileceğinden, transfeksiyon için sağlıklı, aktif olarak büyüyen hücrelerin kullanılması önemlidir.
Hücre tohumu
Tet-213 hücrelerini bir kültür tabağında veya çok oyuklu bir plaka içinde uygun bir yoğunlukta tohumlayın. Tohum yoğunluğu transfeksiyon yöntemine ve deney tipine bağlıdır. Lipid bazlı transfeksiyon için, tipik olarak% 50-80 konflüpsiyonlu bir tohum yoğunluğu önerilir.
Hücre inkübasyonu
Tohumlanmış hücreleri, hücrelerin tohumlama işlemine yapışmasına ve geri kazanmasına izin vermek için transfeksiyondan önce en az 24 saat önce% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
Transfeksiyonu yapmak
Hücreler hazırlandıktan sonra, transfeksiyonu gerçekleştirme zamanı. Tet-213 hücrelerinin lipit bazlı transfeksiyonu için genel bir protokol:
Transfeksiyon reaktifini hazırlayın
Lipid bazlı transfeksiyon reaktifini hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Tipik olarak, bu, reaktifin uygun bir transfeksiyon ortamında seyreltilmesini içerir.
Nükleik asidi hazırlayın
Plazmid DNA veya siRNA gibi transfekte edilecek nükleik asidi hazırlayın. Nükleik asidi uygun bir transfeksiyon ortamında seyreltin.
Transfeksiyon kompleksini oluşturun
Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini ve seyreltilmiş nükleik asidi bir tüp içinde karıştırın ve transfeksiyon kompleksinin oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 15-30 dakika inkübe edin.
Transfeksiyon kompleksini hücrelere ekleyin
Kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve taze transfeksiyon ortamı ile değiştirin. Transfeksiyon kompleksini hücrelere damla açın ve kompleksi eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe değiştirin.
Hücreleri inkübe edin
Transfekte edilmiş hücreleri, nükleik asit tipine ve deneye bağlı olarak, uygun süre boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Plazmid DNA transfeksiyonu için, gen ekspresyonuna izin vermek için genellikle 24-48 saatlik bir inkübasyon süresi yeterlidir.
Transfeksiyon verimliliğinin değerlendirilmesi
Transfeksiyondan sonra, transfeksiyonun başarılı olup olmadığını belirlemek için transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek önemlidir. Transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için çeşitli yöntemler vardır:
Floresan mikroskopisi
Transfekte edilmiş nükleik asit, GFP gibi bir floresan proteini kodlarsa, transfekte edilmiş hücreleri görselleştirmek için floresan mikroskopisi kullanılabilir. Floresan hücrelerin yüzdesi, transfeksiyon verimliliğinin bir tahmini olarak kullanılabilir.
Akış sitometrisi
Akış sitometrisi, bir floresan markerin veya bir hücre yüzeyi antijeninin ekspresyonuna dayanarak transfekte edilmiş hücrelerin yüzdesini ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem, floresan mikroskopisine kıyasla transfeksiyon verimliliğinin daha doğru ve kantitatif bir ölçüsünü sağlar.
Western Blotting veya QPCR
Transfekte edilmiş nükleik asit, ilgili bir proteini kodlarsa, proteinin protein veya mRNA seviyesindeki ekspresyonunu tespit etmek için Western blotlama veya qPCR kullanılabilir. Bu yöntem, gen ekspresyonu seviyesi ve transfekte edilmiş proteinin işlevselliği hakkında bilgi sağlayabilir.
Ortak transfeksiyon problemlerinin giderilmesi
Transfeksiyon bazen zor olabilir ve meydana gelebilecek birkaç yaygın sorun vardır. İşte yaygın transfeksiyon problemleri için bazı sorun giderme ipuçları:
Düşük transfeksiyon verimliliği
- Nükleik asidin kalitesini ve miktarını kontrol edin. Nükleik asidin saf ve yüksek kalitede olduğundan emin olun.
- Transfeksiyon reaktif konsantrasyonu, nükleik asit-reaktif oran ve inkübasyon süresi gibi transfeksiyon koşullarını optimize edin.
- Hücre sağlığını ve canlılığını kontrol edin. Transfeksiyondan önce hücrelerin sağlıklı ve aktif olarak büyüdüğünden emin olun.
- Farklı bir transfeksiyon yöntemi veya reaktif deneyin.
Hücre toksisitesi
- Transfeksiyon reaktifinin veya nükleik asidin konsantrasyonunu azaltın.
- Hücre hasarını en aza indirmek için transfeksiyon koşullarını optimize edin.
- Hücreler için daha az toksik olan farklı bir transfeksiyon yöntemi veya reaktif kullanın.
Değişken transfeksiyon verimliliği
- Hücrelerin eşit ve uygun yoğunlukta tohumlandığından emin olun.
- Transfeksiyon kompleksini hücrelere eklemeden önce iyice karıştırın.
- Değişkenliği en aza indirmek için hücreleri tutarlı koşullar altında inkübe edin.
Çözüm
Tet-213 hücrelerinin transfekte edilmesi zorlayıcı ama ödüllendirici bir süreç olabilir. Doğru transfeksiyon yöntemini seçerek, hücreleri düzgün bir şekilde hazırlayarak ve uygun protokolü takip ederek, yüksek transfeksiyon verimliliği elde edebilir ve güvenilir sonuçlar elde edebilirsiniz. Herhangi bir sorunuz varsa veya TET-213 hücre transfeksiyonu ile daha fazla yardıma ihtiyacınız varsa, lütfen bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. Tet-213 hücrelerinin önde gelen bir tedarikçiyiz ve size yüksek kaliteli hücreler, transfeksiyon reaktifleri ve teknik destek sağlayabiliriz.
Tet-213 hücrelerine ek olarak, ayrıcaGalanan (insan)-Siklo (RGDFC), VeDynorphin A (1-13), amid, domuz. Bu peptitler sinirbilim, kanser araştırması ve ilaç keşfi gibi çeşitli araştırma uygulamalarında kullanılabilir.
Tet-213 hücreleri veya peptitlerimizden herhangi birini satın almakla ilgileniyorsanız, özel ihtiyaçlarınızı tartışmak için lütfen bizimle iletişime geçin. Sizinle çalışmayı ve araştırma hedeflerinize ulaşmanıza yardımcı olmayı dört gözle bekliyoruz.
Referanslar
- Sambrook, J. ve Russell, DW (2001). Moleküler klonlama: bir laboratuvar kılavuzu. Soğuk Spring Harbor Laboratuvar Yayınları.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, Re, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA ve Struhl, K. (ed.). (2002). Moleküler biyolojide mevcut protokoller. John Wiley & Sons.
- Chen, C. ve Okayama, H. (1987). Memeli hücrelerinin plazmid DNA ile yüksek verimli dönüşümü. Moleküler ve Hücresel Biyoloji, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y. ve Hofschneider, PH (1982). Yüksek elektrik alanlarında elektroporasyon yoluyla fare liyoma hücrelerine gen aktarımı. Embo Journal, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, FH, ... & Verma, IM (1996). İn vivo gen iletimi ve bir lentiviral vektör tarafından bükülmeyen hücrelerin stabil transdüksiyonu. Bilim, 272 (5259), 263-267.