Selam! Ben TET - 213 hücre tedarikçisiyim ve bugün bu hücrelerde immünofloresan boyama yapmayı nasıl sağlayacağımı size yönlendireceğim. İmmünofloresan boyama, hücre biyolojisi dünyasında süper yararlı bir tekniktir. Hücreler içindeki belirli proteinleri görselleştirmemize yardımcı olur ve işlevlerini ve konumlarını daha iyi anlamamıza yardımcı olur.
TET'in Hazırlanması - 213 Hücre
İlk olarak, TET - 213 hücremizi hazırlamalıyız. Onları uygun bir kültür ortamında büyüterek başlayın. Bu hücreler genellikle% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin - streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640 gibi bir ortamda iyi iş çıkarır. Hücreleri% 5 co₂ atmosferde 37 ° C'de inkübe edin.
Hücreler yaklaşık% 70 - 80 birleşmeye ulaştığında, boyama işlemine başlama zamanı. Hücreleri 24 iyi bir tabakta lameller üzerine tohumlamanız gerekir. Bu, boyama aşamaları sırasında hücrelerin işlenmesini kolaylaştırır. Hücre süspansiyonunu lamellere dikkatlice aktarmak için bir pipet kullanın. Hücreleri eşit olarak dağıttığınızdan emin olun.
Hücrelerin sabitlenmesi
Hücreler lamellere bağlandıktan sonra (genellikle 24 saat sonra), bunları düzeltmenin zamanı geldi. Fiksasyon, hücre yapısını koruduğu ve proteinleri yerinde tuttuğu için çok önemlidir. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) gibi bir fiksatif kullanabilirsiniz. Tumlar üzerindeki hücreleri örtmek için yeterli PFA ekleyin ve yaklaşık 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmasına izin verin.
Fiksasyon yapıldıktan sonra, hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Her yıkama yaklaşık 5 dakika sürmelidir. Bu, herhangi bir fazla fiksatifin hücrelerden çıkarılmasına yardımcı olur.
Geçirgenlik
Sırada geçirgenizasyon var. Bu adım, antikorların hücrelere girmesine ve hedef proteinlere bağlanmasına izin verir. PBS'de% 0.1 Triton X - 100 gibi bir geçirgenleştirici ajan kullanın. Pisteabilize edici çözeltiyi hücrelere ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika inkübe etmesine izin verin.
Bundan sonra, tıpkı önceki adımda olduğu gibi hücreleri tekrar PBS ile üç kez yıkayın. Bu, geçirgenleştirici ajanın tamamen kaldırılmasını sağlar.
Engelleme
Engelleme, antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için önemli bir adımdır. PBS'de% 5 sığır serum albümini (BSA) gibi bir engelleme çözümü kullanabilirsiniz. Hücrelere bloke etme çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat inkübe etmesine izin verin.
Birincil antikor inkübasyonu
Şimdi birincil antikoru ekleme zamanı. Birincil antikor, Tet - 213 hücrelerinde tespit etmek istediğiniz proteine özgüdür. Üreticinin talimatlarına göre bloke etme çözeltisindeki birincil antikoru seyreltin.
Bloke etme çözeltisini hücrelerden dikkatlice çıkarın ve seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin. Hücreleri antikor çözeltisi ile tamamen örttüğünüzden emin olun. Hücreleri gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile inkübe edin. Bu uzun inkübasyon süresi, antikorun hedef proteine etkili bir şekilde bağlanmasına izin verir.
Ertesi gün, hücreleri üç kez PBS ile yıkayın, her yıkama yaklaşık 5 dakika sürer. Bu, bağlı olmayan herhangi bir birincil antikordan kurtulur.
İkincil antikor inkübasyonu
Birincil antikor inkübasyonundan sonra, ikincil antikor zamanı. İkincil antikor, bir floresan mikroskobu altında hedef proteini görselleştirmemizi sağlayan bir floresan boya ile etiketlenir.
Üreticinin talimatlarına göre bloke etme çözeltisindeki ikincil antikoru seyreltin. PBS'yi hücrelerden çıkarın ve seyreltilmiş ikincil antikoru ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında karanlıkta yaklaşık 1-2 saat inkübe edin. Karanlık ortam, floresan boyanın solmasını önlemek için önemlidir.
İnkübasyon bittiğinde, hücreleri daha önce olduğu gibi üç kez PBS ile yıkayın.
Karşı boyama
Karşı boyama, hücre çekirdeklerini görselleştirmek için kullanılır. DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - fenilindol) gibi bir boya kullanabilirsiniz. DAPI'yi PBS içinde seyreltin ve hücrelere ekleyin. Oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika inkübe etmesine izin verin.
Bundan sonra, fazla DAPI'yi çıkarmak için hücreleri bir kez daha PBS ile yıkayın.
Montaj
Son olarak, lamelleri mikroskop slaytlarına monte etmenin zamanı geldi. Hücreleri yerinde tutmaya yardımcı olan ve floresanı koruyan bir montaj ortamı kullanın. Bir mikroskop slaydına bir damla montaj ortamı dikkatlice yerleştirin ve ardından lamelizi damlaya ters çevirin. Tum ve slayt arasında hapsolmuş hava kabarcıklarının olmadığından emin olun.
Görüntüleme
Şimdi hücreleri bir floresan mikroskobu altında görüntülemeye hazırsınız. İkincil antikor ve DAPI'dan floresan sinyallerini görselleştirmek için uygun filtreleri kullanın. Hücrelerin iyi bir temsilini elde etmek için farklı görüş alanlarında birden fazla görüntü çekebilirsiniz.
Bu süreçte ilgili peptitleri kullanmak
Hücre kültürü ve boyama işlemi sırasında, bazı peptitleri de yararlı bulabilirsiniz. Örneğin,(Gly14) -Hazanin (insan)Hücre canlılığı ve fonksiyonu üzerinde bazı faydalı etkileri olduğu gösterilmiştir. Tet - 213 hücrelerinde çalıştığınız protein ekspresyonunu etkileyip etkilemediğini görmek için kültür ortamına ekleyebilirsiniz.
Fibronektin CS1 peptidihücreleri tohumlamadan önce lamelleri kaplamak için kullanılabilir. Bu, hücre bağlanmasını ve yayılmasını artırabilir, bu da boyama işlemini daha verimli hale getirebilir.
Endotelin - 1 (11 - 21)TET - 213 hücrelerindeki sinyal yollarında da rol oynayabilir. Kültür ortamına ekleyebilir ve daha sonra immünofloresan boyama yoluyla hedef protein ekspresyonunu nasıl etkilediğini inceleyebilirsiniz.
Çözüm
TET - 213 hücreleri üzerinde immünofloresan boyama yapmak biraz zor bir süreç olabilir, ancak bu adımları dikkatle takip ederseniz, bazı harika sonuçlar alabilmelisiniz. Bu hücrelerin biyolojisi hakkında size değerli bilgiler verebilecek güçlü bir tekniktir.
TET - 213 hücre veya bu blogda belirtilen ilgili peptitlerden herhangi birini satın almakla ilgileniyorsanız, daha fazla bilgi için bize ulaşmak ve bir tedarik tartışması başlatmak için çekinmeyin. Tüm hücre biyolojisi ihtiyaçlarınızda size yardımcı olmak için buradayız.
Referanslar
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. ve Walter, P. (2002). Hücrenin moleküler biyolojisi. Garland Bilimi.
- Pollard, TD ve Earnshaw, WC (2004). Hücre Biyolojisi. Saunders.